Задачи

Задача 1. Экстрация растительного масла из рисовых отрубей, нахождение оптимальных методов выделения растительного масла различными способами (подбор экстрагентов, сверхкритичная флюидная экстракция, микроволновая экстракция). Задача будет выполнена оптимизацией процесса экстракции и нахождением оптимального метода для максимального выделения растительного масла из отрубей;

Задача 2. Установление закономерности реакции глицеролиза от реакционной способности различно замещенных карбоновых кислот, от температуры реакционной среды и соотношения реагирующих компонентов, электронных и пространственных эффектов. Очистка полученных моно-, диглицеридов жирных кислот от примесей с использованием методов хроматографии и выделения индивидуальных соединений. Задача будет выполнена нахождением оптимальных условий проведения процесса;

Задача 3. Разработать методы синтеза моно- и ди- глицеридов жирных кислот, содержащих фармакофорные фрагменты для целенаправленного получения соединений, обладающих противоопухолевой активностью. Осуществить синтез моно- и/или ди-глицеридов жирных кислот с фосфорсодержащими производными (амидами фосфора - гексаалкилтриамидофосфитами, хлорангидридами фосфора). Определить оптимальные условия синтеза. Охарактеризовать структуры полученных соединений. Разработать подходы для целенаправленного синтеза катионных аналогов глицерофосфолипидов. Разработать подходы к синтезу моно- и ди- глицеридов жирных кислот, содержащих пространственно-затрудненные фенольные фрагменты;

Задача 4. Установление строения, изучение физико-химических и поверхностно-активных свойств синтезированных соединений. Задача будет выполнена проведением анализа современными физико-химическими методами анализа, такими как ЯМР-, ИК-, хромато-масс спектрометрия, высокоэффективной жидкостной хроматографией и т.д.;

Задача 5. Исследование биологической активности полученных соединений:  (1) Анализ цитотоксического профиля в отношении клеток опухолевого и нормального происхождения; (2) Установление механизмов цитотоксичности - индукция апоптоза, влияние на миграцию и пролиферацию клеток; (3) Определение антиоксидантного статуса - влияние на перекисное окисление липидов и прямая антирадикальная активность.

Ожидаемые результаты

В результате первого года выполнения проекта будут разработаны оптимальные условия получения моно-, диглицеридов жирных кислот выделяемых из растительного масла рисовых отрубей. Будут установлены закономерности реакции переэтерификации от реакционной способности различно замещенных карбоновых кислот, от температуры реакционной среды и соотношения реагирующих компонентов, электронных и пространственных эффектов. В 2024 году и 2025 году будут синтезированы новые производные глицерофосфолипидов взаимодействием глицеридов с фосфорорганическими соединениями (хлорангидриды и амиды фосфора). На основе полученных данных будут подобраны наиболее оптимальные условия реакции, обеспечивающие наибольший выход целевых соединений.В результате проведенных работбудут получены оптимальные способы модификации глицеридов жирных кислот. В ходе второго (2025) года также планируется изучить возможность функционализации производных глицеридов жирных кислот с Р- и N-нуклеофилами (вторичными аминами, трифенилфосфином). Впервые будут получены новые производные глицеридов, имеющих в своем составе аминоалкильные, аммониевые, фосфониевые фрагменты. В результате используемые подходы позволят подойти к целенаправленному созданию митохондриально-ориентированных векторных систем для улучшения противоопухолевой активности глицеридов жирных кислот. С целью синтеза соединений, проявляющих антиоксидантную активность, будут изучены реакции производных глицеридов с сесамолом, тимолом и другими доступными фенолами природного происхождения. В продолжение этих исследований в 2026 году впервые будет изучена возможность введения в моно- и диглицериды жирных кислот пространственно-затрудненных фенольных фрагментов, которые позволят осуществить синтез соединений, оказывающих защитное действие по отношению к здоровому микроокружению и цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам.

2024-2026 гг. Будет изучена цитотоксичность полученных соединений в отношении ряда клеточных линий опухолевого происхождения, включая HeLa (карцинома шейки матки человека), SH-SY5Y (нейробластома человека), A549 (аденокарцинома лёгкого человека), MCF7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека), PA-1 (тератокарцинома яичника человека), Hep2 (карцинома гортани), IMR-32 (нейробластома), а также условно нормальные клетки, полученные из эмбриональной почки человека, HEK-293, с использованием в качестве препаратов сравнения известных лекарственных средств, используемых для терапии онкозаболеваний. Более того, для каждого вещества будут определены индексы селективности с целью выявления соединений, обладающих избирательностью токсического действия именно в отношении клеток опухолевого происхождения. По итогам исследования цитотоксического профиля будет произведен отбор веществ, обладающих выраженной способностью снижать выживаемость клеток опухолевого происхождения и изучены возможные механизмы действия с целью выявления соединений, способных модулировать процессы, связанные с окислительным стрессом, оказывать деструктивное влияние на функционирование митохондрий, а также апоптоз, пролиферацию и миграцию опухолевых клеток. На основе полученных данных будут установлены закономерности «структура-свойство» в ряду производных глицеридов жирных кислот и выявлены наиболее активные соединения-лидеры, перспективные с точки зрения дальнейших исследований и практического внедрения.

1) Полученные в ходе работы результаты будут опубликованы в 5ти публикациях по научному направлению проекта в рецензируемых научных изданиях International Journal of Molecular Sciences (Q1, индекс цитирования 5,6), Pharmaceuticals (Q2, индекс цитирования 4,6), Frontiers in Chemistry (Q1, индекс цитирования 5,5), Anti-Cancer Agentsin Medicinal Chemistry (Q3, индекс цитирования 2,3) или в других индексируемых в Science Citation Index Expanded и входящих в Q1-Q3 по импакт-фактору в базе Web of Science и (или) имеющих процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 60 (шестидесяти); а также 1 статье или обзоре в издании Химический журнал Казахстана или в других изданиях в рецензируемом зарубежном или отечественном издании, рекомендованном КОКСНВО, а также представлены на международных конференциях.

2) опубликование монографий, книг и (или) глав в книгах зарубежных и (или) казахстанских издательств не планируется;

3) получение патентов в зарубежных патентных бюро (европейском, американском, японском), в казахстанском или евразийском патентном бюро: будет получен патент РК на изобретение;

4) разработка научно-технической, конструкторской документации не планируется;

5) распространение результатов работ среди потенциальных пользователей, сообщества ученых и широкой общественности: распространение результатов исследований будут осуществляться участием в международных научных конференциях, через республиканские и региональные средства массовой информации и социальные сети;

6) другие измеримые результаты в соответствии с требованиями конкурсной документации и особенностями проекта. Дополнительно в разделе указываются:

1) область применения и целевые потребители каждого из ожидаемых результатов: В результате реализации предлагаемого проекта будет получена обширная библиотека ранее не описанных производных глицеридов жирных кислот, обладающих высокой цитотоксичностью в отношении раковых клеточных линий, проведен анализ «структура-активность» и выявлены соединения-лидеры, обладающие высокой селективностью действия и нетоксичные в отношении нормальных тканей и клеток. Это, в свою очередь, послужит основой дальнейшему созданию новых типов противоопухолевых агентов и будет способствовать развитию медицинской химии и химии лекарственных препаратов, а также будет являться надежной базой для практического внедрения новых типов высокоселективных и малотоксичных противоопухолевых агентов.

2) влияние ожидаемых результатов на развитие основного научного направления и смежных областей науки и технологий: в качестве целевых потребителей научных результатов проекта могут стать фармацевтические компании, поскольку полученные соединения потенциально будут проявлять широкий спектр биологической активности, пониженную токсичность и смогут быть достойными конкурентами дорогостоящим зарубежным аналогам;

3) применимость и (или) возможность коммерциализации полученных научных результатов: Полученные научные результаты могут использоваться в фармацевтической промышленности и медицине в качестве противоопухолевых препаратов, а также в учебно-образовательном процессе при усовершенствовании учебных планов, разработке лабораторных работ и практик для студентов различных курсов;

4) социальный, экономический, экологический, научно-технический, мультипликативный и (или) иной эффект результатов проекта с обоснованием, в том числе по решению существующих проблем в регионах страны: Результаты, полученные в ходе выполнения данного проекта, существенно расширят современные представления в области органической, медицинской химии, и найдут отражение в современном направлении исследований – валоризация агроотходов.

5) другие прямые и косвенные результаты проекта с указанием их качественных и количественных характеристик: Презентацию результатов планируется провести на международных и отечественных конференциях.

Результаты

Получены растительные масла из рисовых отрубей. Проведена оценка влияния растворителей на процесс экстракции масла из растительного сырья. Обнаружено, что применение этилацетата имел более высокие выходы экстракции в начале и достигал своего максимального выхода за более короткий промежуток времени чем использование других растворителей (ацетон, гексан, хлороформ, ксилол, бензол) из-за лучшей совместимости с маслянистыми соединениями, присутствующими в рисовых отрубях, и его более низкой вязкости. Осуществлен глицеролиз рисового масла с целью получения моно- и диглицеридов жирных кислот различного состава. Обнаружено, что получаемые моно- и диглицериды жирных кислот преимущественно содержат линоленовую и олеиновую кислоты. Применение инструментальных методов анализа (ВЭЖХ, ГЖХ, спектроскопии ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрии) позволили определить состав полученных масел, моно- и диглицеридов жирных кислот.

Разработан оптимальный метод получения моно- и диглицеридов реакцией глицеролиза из растительного масла рисовых отрубей и выделены из реакционных смесей индивидуальные моно- и диглицериды с использованием хроматографии. Применение инструментальных методов анализа (ВЭЖХ, ГЖХ, спектроскопии ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрии) позволили определить состав полученных масел, моно- и диглицеридов жирных кислот Обнаружено, что получаемые моно- и диглицериды жирных кислот преимущественно содержат линоленовую и олеиновую кислоты. Полученные индивидуальные соединения идентифицированы методами ИК-, ЯМР ¹Н и ¹³С спектроскопии, элементного анализа.

Изучено взаимодействие моно-, диглицеридов олеиновой и линоленовой кислот, выделенных из рисового масла, с хлорангидридом фосфора (POCl₃) в присутствии различных оснований (триэтиламин, пиридин, DBU), растворителей (диоксан, толуол, хлороформ, гексан) при комнатной температуре. Установлено, что наиболее оптимальным растворителем в реакции фосфорилирования глицеридов с POCl₃ является толуол и основание триэтиламин. Кроме этого, было обнаружено, что получаемые в результате реакций дихлорангидриды фосфора моно- или диглицеридов жирных кислот претерпевают частичный гидролиз в процессе их выделения, а добавление дистиллированной воды после удаления растворителей позволяет нам получать соответствующие глицеридофосфаты. Осуществлен синтез хлорангидридов бис(хлорметил)фосфиновой и хлорметилфосфоновой кислот по ранее известным методикам и изучена их возможность взаимодействия в присутствии триэтиламина в толуоле при комнатной температуре с моно- и диглицеридами олеиновой и линоленовой кислот. Показано, что в случае реакции глицеридов с хлорметилфосфоновой кислотой происходит гидролиз связи P-Cl с образованием соответствующих эфиров фосфора. Таким образом, в результате проведенных исследований нами были выявлены закономерности протекания реакции фосфорилирования, позволяющие получать эфиры фосфорных кислот диглицеридов олеиновой или линоленовой кислот, а также моноглицеридов олеиновой или линоленовой кислот в виде смесей различного состава. Все синтезированные соединения были охарактеризованы с использованием физико-химических методов анализа (спектроскопия ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрия, ВЭЖХ). Для получения индивидуальных продуктов из полученных смесей эфиров фосфорных кислот моноглицеридов олеиновой и линоленовой кислот был осуществлен подбор элюентов различного состава для их дальнейшего выделения методом колоночной или флэш хроматографии.

В рамках исследования биологических свойств все синтезированные на первом году проекта соединения протестированы в соответствии с планом.

С использованием МТТ-теста, основанного на способности бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток, оценено влияние полученных веществ на выживаемость клеток различного происхождения - опухолевого (SH-SY5Y нейробластома человека, HeLa карцинома шейки матки человека, Hep2 карцинома гортани человека, А549 аденокарцинома легкого человка) и нормального (HEK-293 клетки, полученные из эмбриональной почки человека). Установлено, что полученные соединения в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкМ не проявляют выраженных цитотоксических свойств, снижая жизнеспособность клеток не более чем на 13,24±0,98%, при этом отличий в проявляемом действии в зависимости от клеточных линий не было выявлено, что свидетельствует об отсутствии селективности действия веществ (SI < 1).

Оценка влияния веществ на процессы, связанные с окислительным стрессом, посредством анализа их влияния на перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс, основанного на реакции 2-тиобарбитуровой кислоты с промежуточными продуктами перекисного окисления липидов, в результате которой образуется окрашенный триметиновый комплекс, главная роль при образовании которого принадлежит малоновому диальдегиду, позволила обнаружить, что полученные соединения в концентрации 100 мкМ обладают умеренной антиоксидантной активностью в диапазоне от 21,06±0,33% до 32,76±3,31%.

При оценке антирадикальной активности соединений посредством анализа способности веществ нейтрализовать хромоген-радикал ДФПГ(2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) и железохелатирующей способности с помощью метода, основным принципом которого является конкурентное связывание веществ-хелаторов и феррозина ((3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-фенилсульфоновая

кислота)-1,2,4-триазин)) с ионами железа, не было обнаружено способности веществ нейтрализовать свободные радикалы и оказывать железосвязывающие свойства, что может быть связано с иным механизмом антиоксидантного действия соединений.

При исследовании возможных механизмов противоопухолевого действия соединений, а именно, способности приводить к митохондриальной дисфункции, запускать гибель опухолевых клеток по пути апоптоза и оказывать влияние на пролиферацию и миграцию клеток опухолевого происхождения, не было обнаружено активности веществ в отношении вышеуказанных процессов, что свидетельствует о необходимости проведения дальнейших химических модификаций полученных соединений с целью создания более эффективных молекул с противоопухолевым типом действия.

Neganova, M., Aleksandrova, Y., Voloshina, A., Lyubina, A., Appazov, N., Yespenbetova, S., Valiullina, Z., Samorodov, A., Bukharov, S., Gibadullina, E., Tapalova, A. and Bogdanov, A. / Biological Activity Evaluation of Phenolic Isatin-3-Hydrazones Containing a Quaternary Ammonium Center of Various Structures // International Journal of Molecular Sciences, 2024. Vol. 25(20), 11130.

https://doi.org/10.3390/ijms252011130

https://www.mdpi.com/1422-0067/25/20/11130

По результатам проведённых исследований опубликован 1 тезис в XII Международном Беремжановском съезде по химии и химической технологии на тему: Получение моноглицеридов жирных кислот из рисового масла / Алимхан Б.Г., Аппазов Н.О. // XII Международный Беремжановский съезд по химии и химической технологии, 4-6 декабря, 2024, Алматы, Казахстан. Сборник тезисов докладов [Электронное издание]. — Алматы: НАО «КазНУ им. аль-Фараби», 2024. – C. 109.

https://beremzhanovcongress.kz/ru/glavnaya/

https://beremzhanovcongress.kz/wp-content/uploads/2024/12/%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BD%D0%B8%D0%BA-3-1.pdf

* Подготовлен промежуточный отчет, содержащий полную информацию о: выделении из рисовых отрубей растительных масел; подборе оптимального метода получения из растительного масла моно- и диглицеридов; синтезе хлорангидридов фосфора (например, хлорангидриды фосфиновой и фосфоновой кислот) и проведении комплексного тестирования in vitro потенциальной противоопухолевой активности соединений, выделенных и синтезированных на первом году реализации проекта.