Задачи

1. Химический и физико-химический анализ почвы (содержание биогенных элементов, влажность, температура, рН, соленость) и загрязнителя (углеводороды нефти) для оценки условий функционирования микробиома почв Приаральского региона. Анализ почвы будут проведены спектральными, хроматографическим, гравиметрическим и титриметрическим методами анализа.

2. Метагенномные исследования таксономического и метаболического и генетического разнообразия нативного микробиома почв Приаральского региона в зависимости от сезона (времени года) для оценки их биотехнологического потенциала. Образцы почвы будут отобраны в разное время года. Таксономическое, метаболическое и генетическое разнообразие нативного микробиома почв будет оценено с помощью биоинформатичесого анализа результатов метагеномного секвенирования образцов почвенной ДНК.

3. Метагенномные исследования таксономического и метаболического и генетического разнообразия микробиома пустынной почвы, загрязненной нефтью, для оценки влияния загрязнения нефтью на структуру и сукцессию микробиома почвы Приаральского региона. Образцы почвы будут отобраны до и после нефтяного загрязнения. Влияние загрязнения нефтью на таксономическое и метаболическое и генетическое разнообразие микробиома пустынной почвы будет оценено с помощью биоинформатичесого анализа результатов метагеномного секвенирования образцов почвенной ДНК.

4. Выделение индивидуальных культур штаммов – деструкторов углеводородов как потенциальных объектов биотехнологии, компонентов новых биопрепаратов для ремедиации загрязненных почв Приаральского региона, анализ их геномов и оценка возможности расширения деградативного потенциала (за счёт катаболических плазмид). Чистые культуры штаммов – деструкторов углеводородов будут выделены методами накопительного культивирования и прямого высева на селективные среды. На основании результатов анализа полногеномного секвенирования наиболее активных штаммов будут выявлены катаболические гены и определена их хромосомная или плазмидная локализация. Возможность расширения катаболических способностей наиболее эффективных штаммов- нефтедеструкторов будет исследована путем переноса в них плазмид биодеградации различных поллютантов.

5. Исследование процессов биостимуляции аборигенных микроорганизмов почв Приаральского региона путем внесения минеральных питательных добавок. Эффективность  биостимуляции аборигенных микроорганизмов углеводородов будет оценена по убыли содержания общих углеводородов после внесения в почву биогенных элементов в составе фосфорных и азотных минеральных удобрений.

6.  Исследование процессов биоаугментации почвы Приаральского региона за счет внесения исследованных активных аборигеных микроорганизмов-деструкторов, выделенных из почв Приаральского региона, или за счет интродукции ранее разработанного биопрепарата (Патент на изобретение Республики Казахстан №33715). Эффективность биоаугментации будет  оценена по убыли содержания общих углеводородов после внесения в почву выделенных активных аборигенных микроорганизмов-деструкторов углеводородов или эффективной ассоциации штаммов-нефтедеструкторов в составе ранее разработанного биопрепарата.

7. Разработка стратегии биоремедиации нефтезагрязнённых почв Приаральского региона на основании результатов исследования эффективности процессов самоочищения почв, биостимуляции и биоаугментации. На основании данных по убыли содержания общих углеводородов в полевых модельных экспериментах в результате  самоочищения почв, применения подходов биостимуляции или биоаугментации будет разработана стратегия биоремедиации нефтезагрязнённых почв Приаральского региона.

Ожидаемые результаты

В течение первого года выполнения проекта будет осуществлена оценка таксономического и метаболического разнообразия нативного микробиома и влияния загрязнения нефтью на нативный почвенный микробиом.

В результате первого года выполнения проекта будут получены данные по физико-химическим параметрам (солёность, влажность, температуры, кислотность) и химическому составу почвы (в том числе наличию и количеству биогенных элементов (N, P, K)), до и после внесения нефти. Будет получены данные по химическому составу нефти по фракциям и содержанию нефти в почве в ходе эксперимента (0, 14, 30, 60, 180 сут).

Будут отсеквенированы микробиомы почвенных образцов до и после загрязнения нефтью. Будут получены результаты анализа микробиомов в виде сырых прочтений, таксономически классифицированных, а также контигов. Из контигов будет выполнен биннинг и собраны метагеном-собранные геномы metagenome-assembled genomes (MAGs)). Будут определены доминирующие фракции (таксоны) микробиомов.

Будет изучена возможность выделения и культивирования аборигенных почвенных микроорганизмов-нефтедеструкторов в лабораторных условиях методом накопительного культивирования образцов почвы в минеральных средах с углеводородными источниками углерода и энергии будут получены представления о соотношении общей численности культивируемых микроорганизмов и численности микроорганизмов-нефтедеструкторов, а также о влиянии нефтяного загрязнения на эти показатели. Будут выделены чистые культуры наиболее активных микроорганизмов-нефтедеструкторов для дальнейшего их изучения.

В течение второго года выполнения проекта будут изучены особенности генетической организации и деградативный потенциал аборигенных штаммов – перспективных деструкторов углеводородов

Будут получены данные о спектре субстратов, утилизируемых наиболее активными аборигенными штаммами-нефтедеструкторами (алифатические, ароматические, циклические неароматические углеводороды), и пределах выживаемости штаммов при различных температурах и содержании соли в среде культивирования. Будет создана коллекция наиболее перспективных для биоремедиации штаммов-нефтедеструкторов.

Будут получены полные последовательности геномов штаммов, отобранных как наиболее перспективные деструкторы углеводородов. В геномах будут выявлены гены и опероны, вовлечённые в катаболизм углеводородов. Будет определена локализация (хромосомная, плазмидная) указанных генов и оперонов.

Будет изучена возможность переноса мобильных элементов (плазмид), содержащих гены и опероны катаболизма углеводородов, как между представителями одного рода, так и разных родов. Предполагается, что будут получены трансконъюганты, определена их стабильность и возможность применения для деструкции углеводородов нефти.

В течение третьего года выполнения проекта будет разработана стратегии биоремедиации на основании эффективности биодеградации углеводородов нефти в зависимости от результатов различных подходов в полевом эксперименте по очистке загрязнённой нефтью почвы (биостимуляция/биоаугментация)

Будут получены сухие лиофилизированные препараты или биомасса в виде концентрированной суспензии каждой культуры, которые будут использованы в ремедиационных экспериментах. Будет проверена степень выживаемости культур и их чистота после концентрирования и лиофилизации. Будет определена эффективность биодеградации нефти при биостимуляции (внесение минеральных удобрений) в результате деструкции нефти микроорганизмами. Будет определено влияние биостимуляции на изменение нативного микробиома почвы.

Будет определена эффективность биодеградации нефти при биоаугментации (внесение минеральных удобрений и реинтродукция аборигенных микроорганимов-нефтедеструкторов) в результате деструкции нефти микроорганизмами. Будет определено влияние биоаугментации на изменение нативного микробиома почвы

Будет определена эффективность биодеградации нефти при биоаугментации (внесение минеральных удобрений и ранее разработанного консорциума микроорганизмов-нефтедеструкторов) в результате деструкции нефти микроорганизмами. Будет определено влияние биоаугментации на изменение нативного микробиома почвы.

Будут отсеквенированы почвенные микробиомы после полевых экспериментов по биостимуляции, реинтродукции аборигенных нефтедеструкторов и внесения ранее разработанного консорциума микроорганизмов, выполнена таксономическая классификация и сборка метагеномов de novo. В метагеномах будут выявлены метаболические пути катаболизма углеводородов и оценена их представленность прочтениями.

На основании полученных результатов будет сделано заключение об эффективности ремедиационных подходов. Будет разработана наиболее эффективная стратегия биоремедиации загрязнённых нефтью почв Приаральского региона

1) По результатам проведённых исследований будет опубликованы 3 статьи в изданиях: одна статья в журнале Microorganisms (Q2, индекс цитирования 0,8), одна статья в журнале Frontiers in Microbiology (Q2, индекс цитирования 0,96), одна статья в журнале PLOS One (Q2, индекс цитирования 0,91) или в других изданиях индексируемых в Science Citation Index Expanded и входящих в Q1, Q2, Q3 по импакт-фактору в базе Web of Science или имеющих процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 60 и 1 статья издании Известия НАН РК. Серия химии и технологии или в других изданиях рекомендованном КОКСНВО.

2) опубликование монографий, книг и (или) глав в книгах зарубежных и (или) казахстанских издательств не планируется.

3) планируется подача заявки на получение патента в казахстанском патентном бюро;

4) разработка научно-технической, конструкторской документации не планируется;

5) распространение результатов работ среди потенциальных пользователей, сообщества ученых и широкой общественности: распространение результатов исследований будут осуществляться участием в международных научных конференциях, через республиканские и региональные средства массовой информации и социальные сети;

6) другие измеримые результаты в соответствии с требованиями конкурсной документации и особенностями проекта. Дополнительно в разделе указываются:

1) область применения и целевые потребители каждого из ожидаемых результатов:

Целевыми потребителями результатов проекта могут быть нефтедобывающие и транспортные компании, нефтеперерабатывающие предприятия, структуры МЧС, контролирующие органы. Результаты, полученные в ходе выполнения данного проекта, могут найти применение при разработке технологий для ликвидации аварийных разливов нефти и нефтепродуктов в местах добычи нефти, в местах переработки, на территориях баз горюче-смазочных материалов, автозаправочных станций, аэродромов и полигонов, а также участков побережья, загрязненных нефтепродуктами.

2) влияние ожидаемых результатов на развитие основного научного направления и смежных областей науки и технологий: результаты выполнения данного проекта внесут существенный вклад в развитие научных направлений экобиотехнология, биотехнологии защиты окружающей среды от антропогенных загрязнений, разработка новых биопрепаратов и технологий для рекультивации загрязнённых нефтью территорий. Н результаты проекта могут быть использованы в учебных программах университетов и научно-исследовательских организаций по специальностям «Биология», «Микробиология», «Биотехнология», «Экология», при чтении лекций и выполнении практических занятий, планировании НИР и НИОКР в области рекультивации нарушенных земель.

3) применимость и (или) возможность коммерциализации полученных научных результатов: на наиболее эффективные штаммы-нефтедеструкторы или их ассоциации будут поданы заявки на патенты Республики Казахстан, что обеспечит возможность их коммерциализации, разработки оригинальных инновационных биотехнологий, предусматривающих создание новых рабочих мест.

4) социальный, экономический, экологический, научно-технический, мультипликативный и (или) иной эффект результатов проекта с обоснованием: результаты, полученные в ходе выполнения данного проекта, существенно расширят современные представления о разработке стратегии биоремедиации и рекультивации почв, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, расширят полученные на основании метагеномного анализа знания о разнообразии и сукцессии микробиомов почв, нарушенных в результате техногенных воздействий.

5) другие прямые и косвенные результаты проекта с указанием их качественных и количественных характеристик: результаты проекта будут опубликованы в высокорейтинговых международных журналах и доложены на международных и отечественных конференциях.

Результаты

Получены данные по физико-химическим параметрам (солёность, влажность, температуры, кислотность) и химическому составу почвы (в том числе наличию и количеству биогенных элементов (N, P, K)), до и после внесения нефти. Получены данные по химическому составу нефти по фракциям и содержанию нефти в почве в ходе эксперимента (0, 14, 30, 60, 180 сут).

Методом хромато-масс спектрометрии (Agilent 7890A/5975C, США) определен детальный и количественный состав нефти из образца почвын (нефть использовали месторождения Акшабулак). Количество соединении в составе нефти из образца загрязненной пробы почвы, очищенные от асфальтенов и смол – 220.

Изучены степень деструкции нефти исследуемыми штаммами в жидкой минеральной среде с 2% нефти при 24ºС и 5ºС в течение 10 дней. На основании определения степени деструкции нефти индивидуальными штаммами было составлено 4 ассоциации микроорганизмов – эффективных деструкторов углеводородов нефти. Методами гравиметрии и ИК-спектрофотометрии была определена степень биодеградации нефти этими ассоциациями, которая составила от 30 до 70%.

Метагеномное секвенирование полного гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) зарекомендовало себя как мощная стратегия таксономической классификации бактерий. Эксперимент по секвенированию метагеномов грунта состоял в следующем. Ген 16S рРНК бактерий содержит девять вариабельных областей (V1 - V9), которые разделены высококонсервативными последовательностями в различных таксонах. Для идентификации бактерий ген 16S рРНК сначала амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, отжигающимися от консервативных областей, а затем секвенировали. Данные секвенирования были обработаны посредством биоинформатического анализа, в ходе которого вариабельные регионы использовали для дискриминации бактериальных таксонов. В контрольных (незагрязнённых) образцах установлено присутствие  Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria и Bacteroidetes.

Установлено, что в течение первых 15 суток после внесения нефти в микробиоме увеличивается доля актинобактерий и протеобактерий, которые обладают разнообразным репертуаром генов катаболизма алканов и ПАУ. Также отмечали присутствие бацилл. Таксономическое разнообразие и состав сообщества на 60 сутки эксперимента демонстрируют тенденцию стабилизации и возвращения микробиома в исходное состояние, данный образец по составу похож на контрольный. Это согласуется с данными, полученными из литературы, о том, что аборигенные микробиомы почв демонстрируют микробный ответ на стресс в течение первых 2-3 месяцев, после чего микробиом стабилизируется в исходном виде.

В исследуемой как незагрязненной, так и в загрязненной нефтью почве общая численность культивируемых микроорганизмов в течении 60 суток была невысока и составляла порядка 2-4×10⁶ КОЕ/г почвы.  Численность микроорганизмов-нефтедеструкторов в течение первых 30 суток была невелика и составляла 2-4×10² КОЕ/г почвы (составляла около  0,01% от общей численности культивируемых микроорганизмов). Однако к 60-м суткам отмечена тенденция к небольшому увеличению численности нефтедеструкторов до 4-5×10³ КОЕ/г почвы (составляла около 0,1% от общей численности культивируемых микроорганизмов).

Были выделены перспективные культуры нефтеокисляющих микроорганизмов, способных к росту на нефти, дизельном топливе, н-алканах (гексадекан), полициклических ароматических углеводородах (нафталин), моноциклических ароматических углеводородах (толуол, фенол).