Міндеттер

1. Арал маңы өңірі топырақтарының микробиомының қызмет ету жағдайларын бағалау мақсатында топырақтың химиялық және физика-химиялық талдауы (биогенді элементтердің мөлшері, ылғалдылығы, температурасы, рН көрсеткіші, тұздылығы) және ластаушы заттың (мұнай көмірсутектері) құрамын анықтау жүргізіледі. Топырақ талдаулары спектралдық, хроматографиялық, гравиметриялық және титриметриялық әдістер арқылы орындалады.

2. Арал маңы өңірі топырақтарының нативті микробиомының таксономиялық, метаболикалық және генетикалық алуантүрлілігін маусымдық (жыл мезгілдері бойынша) өзгерісіне байланысты бағалау үшін метагеномдық зерттеулер жүргізіледі. Топырақ үлгілері жыл мезгілдеріне сәйкес әртүрлі уақытта алынады. Нативті микробиомның таксономиялық, метаболикалық және генетикалық алуантүрлілігі топырақтан бөлінген ДНҚ үлгілерін метагеномдық секвенирлеу нәтижелерін биоинформатикалық талдау арқылы анықталады.

3. Мұнаймен ластанған шөлейт топырақ микробиомының таксономиялық, метаболикалық және генетикалық алуантүрлілігін зерттеу үшін метагеномдық талдау жүргізіледі. Бұл зерттеулер мұнаймен ластанудың Арал маңы өңірі топырағы микробиомының құрылымы мен сукцессиясына әсерін бағалауға бағытталған. Топырақ үлгілері мұнаймен ластанғанға дейін және кейін алынады. Мұнаймен ластанудың микробиомның таксономиялық, метаболикалық және генетикалық алуантүрлілігіне әсері топырақ ДНҚ-сының метагеномдық секвенирлеу нәтижелерін биоинформатикалық талдау негізінде бағаланады.

4. Көмірсутектерді ыдыратушы штаммдардың жеке дақылдарын биотехнологияның әлеуетті объектілері, сондай-ақ Арал маңы өңірінің ластанған топырақтарын ремедиациялауға арналған жаңа биопрепараттардың компоненттері ретінде бөліп алу, олардың геномдарын талдау және деградациялық әлеуетін (катаболикалық плазмидалар есебінен) кеңейту мүмкіндігін бағалау жүргізіледі. Көмірсутектерді ыдыратушы штаммдардың таза дақылдары жинақтап өсіру және селективті қоректік орталарға тікелей егу әдістері арқылы бөлініп алынады. Ең белсенді штаммдардың толықгеномдық секвенирлеу нәтижелеріне сүйене отырып, катаболикалық гендер анықталып, олардың хромосомалық немесе плазмидалық локализациясы белгіленеді. Ең тиімді мұнай тотықтырғыш штаммдардың катаболикалық мүмкіндіктерін кеңейту әртүрлі ластаушы заттардың биодеградациясына жауапты плазмидаларды енгізу арқылы зерттеледі.

5. Арал маңы өңірі топырақтарының аборигенді микроорганизмдерін минералдық қоректік қоспаларды енгізу арқылы биостимуляциялау процестері зерттеледі. Көмірсутектерді ыдырататын аборигенді микроорганизмдердің биостимуляциясының тиімділігі топыраққа фосфор және азотты минералдық тыңайтқыштар құрамындағы биогенді элементтер енгізілгеннен кейін жалпы көмірсутектер мөлшерінің азаюы бойынша бағаланады.

6. Арал маңы өңірі топырағын биоаугментациялау процестері зерттеледі: бұл зерттелген белсенді аборигенді микроорганизм-деструкторларды, яғни Арал маңы өңірі топырағынан бөлініп алынған штаммдарды енгізу немесе бұрын әзірленген биопрепаратты (Қазақстан Республикасының №33715 өнертабыс патенті) қолдану арқылы жүзеге асырылады. Биоаугментация тиімділігі топыраққа енгізілген белсенді аборигенді көмірсутек-деструктор микроорганизмдер немесе бұрын әзірленген биопрепарат құрамындағы тиімді штаммдар қауымдастығы әсерінен жалпы көмірсутектер мөлшерінің азаюы арқылы бағаланады.

7. Топырақтың өзін-өзі тазарту, биостимуляция және биоаугментация процестерінің тиімділігін зерттеу нәтижелері негізінде Арал маңы өңірінің мұнаймен ластанған топырақтарын биоремедиациялау стратегиясы әзірленеді. Далалық модельдік тәжірибелер барысында топырақтың өзін-өзі тазарту, биостимуляция немесе биоаугментация тәсілдерін қолдану нәтижесінде жалпы көмірсутектер мөлшерінің төмендеуі туралы деректерге сүйене отырып, мұнаймен ластанған топырақтарды биоремедиациялау стратегиясы қалыптастырылады.

Күтілетін нәтижелер

Жобаның бірінші жылында жергілікті микробиоманың таксономиялық және метаболикалық әртүрлілігі және мұнайдың ластануының жергілікті топырақ микробиомасына әсері бағаланады.

Жобаның бірінші жылының нәтижесінде топырақтың физика-химиялық параметрлері (тұздылығы, ылғалдылығы, температурасы, қышқылдығы) және химиялық құрамы (соның ішінде биогенді элементтердің (N, P, K) болуы мен мөлшері) бойынша, мұнай енгізілгенге дейін және енгізілгеннен кейінгі деректер алынады. Сонымен қатар, тәжірибе барысында (0, 14, 30, 60, 180 тәулік) топырақтағы мұнай мөлшері мен мұнайдың фракциялық құрамы туралы мәліметтер алынады.

Мұнаймен ластанғанға дейін және кейін алынған топырақ үлгілерінің микробиомдары секвенирленеді. Микробиомдарды талдау нәтижесінде бастапқы реттік оқылымдар, таксономиялық жіктелген деректер және контигтер алынады. Контигтер негізінде биннинг жүргізіліп, метагеномдық түрде жинақталған геномдар (MAGs) құрастырылады. Микробиомалардың басым фракциялары (таксондары) анықталады.

Аборигенді топырақ микроорганизмдерінің мұнайды ыдыратушы түрлерін зертханалық жағдайда бөліп алу және өсіру мүмкіндігі қарастырылады. Бұл үшін топырақ үлгілерін көмірсутектерді көміртек пен энергия көзі ретінде пайдаланатын минералдық қоректік орталарда жинақтап өсіру әдісі қолданылады. Нәтижесінде культивирленетін микроорганизмдердің жалпы саны мен мұнайды ыдыратушы микроорганизмдер санының арақатынасы, сондай-ақ мұнаймен ластанудың осы көрсеткіштерге әсері туралы мәліметтер алынады. Ең белсенді мұнайды ыдыратушы микроорганизмдердің таза дақылдары бөлініп алынып, кейінгі зерттеулер үшін іріктеледі.

Жобаны орындаудың екінші жылы барысында аборигенді штаммдардың – көмірсутектерді ыдыратуға қабілетті перспективалы деструкторлардың генетикалық ұйымдасу ерекшеліктері мен деградациялық әлеуеті зерттеледі.

Ең белсенді аборигенді мұнайды ыдыратушы штаммдар пайдаланатын субстраттар спектрі (алифатты, ароматты және циклдік бейароматты көмірсутектер), сондай-ақ әртүрлі температура мен қоректік ортадағы тұз мөлшері жағдайларында штаммдардың тіршілік ету шектері туралы деректер алынады. Биоремедиация үшін ең перспективалы мұнайды ыдыратушы штаммдардың коллекциясы жасақталады.

Көмірсутектерді ыдыратуға қабілетті ең перспективалы штаммдар ретінде іріктелген микроорганизмдердің толық геномдық тізбектері алынады. Геномдарда көмірсутектер катаболизміне қатысатын гендер мен оперондар анықталады. Аталған гендер мен оперондардың локализациясы (хромосомалық немесе плазмидалық) белгіленеді.

Көмірсутектер катаболизміне жауапты гендер мен оперондарды қамтитын жылжымалы генетикалық элементтердің (плазмидалардың) бір туыс өкілдері арасында да, әртүрлі туыстар арасында да тасымалдану мүмкіндігі зерттеледі. Нәтижесінде трансконъюганттар алынып, олардың тұрақтылығы мен мұнай көмірсутектерін ыдыратуда қолдану мүмкіндігі бағаланады.

Жобаны орындаудың үшінші жылы барысында мұнаймен ластанған топырақты тазарту бойынша далалық тәжірибеде қолданылған әртүрлі тәсілдердің (биостимуляция және биоаугментация) нәтижелеріне, сондай-ақ мұнай көмірсутектерінің биодеградация тиімділігіне сүйене отырып, биоремедиация стратегиясы әзірленеді.

Әрбір дақыл үшін құрғақ лиофильденген препараттар немесе концентрленген суспензия түріндегі биомасса алынып, олар ремедиациялық тәжірибелерде қолданылады. Концентрлеу және лиофильдеу үдерістерінен кейін дақылдардың тіршілікке қабілеттілігі мен тазалық дәрежесі тексеріледі. Микроорганизмдердің мұнайды ыдыратуы нәтижесінде минералдық тыңайтқыштарды енгізу арқылы жүзеге асырылатын биостимуляция жағдайында мұнайдың биодеградация тиімділігі анықталады. Сондай-ақ биостимуляцияның топырақтың нативті микробиомының өзгеруіне әсері бағаланады.

Микроорганизмдердің мұнайды ыдыратуы нәтижесінде минералдық тыңайтқыштарды енгізу және аборигенді мұнайды ыдыратушы микроорганизмдерді қайта енгізу арқылы жүзеге асырылатын биоаугментация жағдайында мұнайдың биодеградация тиімділігі анықталады. Сонымен қатар биоаугментацияның топырақтың нативті микробиомының өзгеруіне әсері бағаланады.

Микроорганизмдердің мұнайды ыдыратуы нәтижесінде минералдық тыңайтқыштарды енгізу және бұрын әзірленген мұнайды ыдыратушы микроорганизмдер консорциумын қолдану арқылы жүзеге асырылатын биоаугментация жағдайында мұнайдың биодеградация тиімділігі анықталады. Сондай-ақ биоаугментацияның топырақтың нативті микробиомының өзгеруіне әсері бағаланады.

Далалық тәжірибелерден кейін (биостимуляция, аборигенді мұнайды ыдыратушыларды қайта енгізу және бұрын әзірленген микроорганизмдер консорциумын қолдану) топырақ микробиомдары секвенирленеді, таксономиялық жіктелуі жүргізіледі және метагеномдар de novo тәсілімен құрастырылады. Метагеномдарда көмірсутектер катаболизміне қатысатын метаболикалық жолдар анықталып, олардың оқылымдармен қамтылу деңгейі бағаланады.

Алынған нәтижелер негізінде ремедиациялық тәсілдердің тиімділігі туралы қорытынды жасалады. Арал маңы өңірінің мұнаймен ластанған топырақтарын биоремедиациялаудың ең тиімді стратегиясы әзірленеді.

Алынған нәтижелер негізінде ремедиациялық тәсілдердің тиімділігі туралы қорытынды жасалады. Арал маңы өңірінің мұнаймен ластанған топырақтарын биоремедиациялаудың ең тиімді стратегиясы әзірленеді.

Жүргізілген зерттеулер нәтижелері бойынша ғылыми басылымдарда 3 мақала жарияланады: бір мақала Microorganisms журналында (Q2, дәйексөздік индексі 0,8), бір мақала Frontiers in Microbiology журналында (Q2, дәйексөздік индексі 0,96), бір мақала PLOS One журналында (Q2, дәйексөздік индексі 0,91) немесе Science Citation Index Expanded дерекқорында индекстелетін және Web of Science базасында импакт-фактор бойынша Q1, Q2, Q3 санаттарына кіретін не Scopus базасында CiteScore көрсеткіші бойынша кемінде 60 процентильге ие басқа басылымдарда жарияланады. Сондай-ақ 1 мақала «Қазақстан Республикасы Ұлттық ғылым академиясының хабарлары. Химия және технология сериясы» басылымында немесе Ғылым және жоғары білім саласындағы сапаны қамтамасыз ету комитеті ұсынған басқа журналдарда жарияланады.

Шетелдік және (немесе) қазақстандық баспаларда монографиялар, кітаптар және (немесе) кітап тарауларын жариялау жоспарланбайды.

Қазақстан Республикасының патенттік ведомствосына патент алуға өтінім беру жоспарлануда.

Ғылыми-техникалық және конструкторлық құжаттамаларды әзірлеу жоспарланбайды.

Жұмыс нәтижелерін әлеуетті пайдаланушылар, ғылыми қауымдастық және кең жұртшылық арасында тарату: зерттеу нәтижелері халықаралық ғылыми конференцияларға қатысу арқылы, сондай-ақ республикалық және өңірлік бұқаралық ақпарат құралдары мен әлеуметтік желілер арқылы жарияланады.

Байқау құжаттамасының талаптарына және жобаның ерекшеліктеріне сәйкес басқа да өлшенетін нәтижелер көзделеді. Қосымша бөлімде көрсетіледі:

1) әрбір күтілетін нәтижелердің қолдану саласы және мақсатты тұтынушылары:

Жобаның нәтижелерінің мақсатты тұтынушылары мұнай өндіру және тасымалдау компаниялары, мұнай өңдеу кәсіпорындары, ТЖД құрылымдары, бақылау органдары болуы мүмкін. Осы жобаны орындау барысында алынған нәтижелер мұнай өндіру орындарында, өңдеу орындарында, жанармай-мұнай өнімдері базаларында, автозаправка станцияларында, әуежайларда және полигондарда, сонымен қатар мұнай өнімдерімен ластанған жағалау учаскелерінде апаттық мұнай және мұнай өнімдерінің төгінділерін жою технологияларын әзірлеу кезінде қолданылуы мүмкін.

2) негізгі ғылыми бағыттардың және ғылым мен технологияның байланысты салаларының дамуына күтілетін нәтижелердің әсері: аталған жобаны орындау нәтижелері экобиотехнология, табиғатты антропогендік ластанудан қорғаудың биотехнологиясы, жаңа биопрепараттар мен мұнаймен ластанған аумақтарды қалпына келтіру технологияларын әзірлеу сияқты ғылыми бағыттардың дамуына елеулі үлес қосады. Жобаның нәтижелері университеттер мен ғылыми-зерттеу ұйымдарының «Биология», «Микробиология», «Биотехнология», «Экология» мамандықтары бойынша оқу бағдарламаларында, дәрістер жүргізу және практикалық сабақтар өткізу кезінде, сондай-ақ зақымдалған жерлерді қалпына келтіру саласында ғылыми-зерттеу және тәжірибелік-конструкторлық жұмыстарды жоспарлау кезінде қолданылуы мүмкін.

3) алынған ғылыми нәтижелердің қолданылуы және (немесе) коммерциялану мүмкіндігі: ең тиімді мұнайды бұзатын штаммдарға немесе олардың ассоциацияларына Қазақстан Республикасында патент алу өтініштері берілетін болады, бұл олардың коммерциялану мүмкіндігін, сондай-ақ жаңа жұмыс орындарын құруды көздейтін оригиналды инновациялық биотехнологияларды әзірлеуді қамтамасыз етеді.

4) жоба нәтижелерінің әлеуметтік, экономикалық, экологиялық, ғылыми-техникалық, мультипликативті және (немесе) басқа да әсері негіздемесімен: осы жобаны іске асыру барысында алынған нәтижелер мұнай және мұнай өнімдерімен ластанған топырақтарды биоремедиациялау және қалпына келтіру стратегиясын әзірлеу туралы қазіргі түсінікті айтарлықтай кеңейтеді және техногендік әсерлер нәтижесінде бұзылған топырақ микробиомдарының әртүрлілігі мен сабақтастығы туралы метагеномдық талдау негізінде алынған білімді кеңейтеді.

5) жобаның басқа да тікелей және жанама нәтижелері, олардың сапалық және сандық сипаттамаларын көрсете отырып: жобаның нәтижелері жоғары рейтингі бар халықаралық журналдарда жарияланады және халықаралық және отандық конференцияларда баяндалады.

Нәтижелер

Топырақтың физика-химиялық параметрлері (тұздылығы, ылғалдылығы, температурасы, қышқылдығы) және химиялық құрамы (соның ішінде биогенді элементтердің (N, P, K) болуы мен мөлшері) бойынша, мұнай енгізілгенге дейін және енгізілгеннен кейін деректер алынды. Сонымен қатар тәжірибе барысында (0, 14, 30, 60, 180 тәулік) топырақтағы мұнай мөлшері мен мұнайдың фракциялық құрамы туралы мәліметтер алынды.

Хромато-масс-спектрометрия әдісімен (Agilent 7890A/5975C, АҚШ) топырақ үлгісінен алынған мұнайдың құрамына егжей-тегжейлі және сандық талдау жүргізілді (мұнай Ақшабұлақ кен орнынан алынған). Асфальтендер мен шайырлардан тазартылған ластанған топырақ үлгісіндегі мұнай құрамындағы қосылыстар саны – 220.

Зерттелетін штаммдардың мұнайды ыдырату дәрежесі құрамында 2% мұнай бар сұйық минералдық ортада 24 ºС және 5 ºС температурада 10 тәулік бойы зерттелді. Жекелеген штаммдардың мұнайды ыдырату дәрежесін анықтау негізінде мұнай көмірсутектерін тиімді ыдырататын 4 микроорганизмдер қауымдастығы құрастырылды. Гравиметриялық және инфрақызыл спектрофотометрия әдістері арқылы осы қауымдастықтардың мұнайды биодеградациялау дәрежесі анықталып, ол 30–70% аралығында болды.

16S рибосомалық РНҚ (рРНҚ) генінің толық метагеномдық секвенирлеуі бактерияларды таксономиялық жіктеудің тиімді стратегиясы ретінде кеңінен танылған. Топырақ метагеномдарын секвенирлеу тәжірибесі келесідей жүргізілді. Бактериялардың 16S рРНҚ гені әртүрлі таксондарда жоғары консервативті тізбектермен бөлінген тоғыз вариабельді аймақтан (V1–V9) тұрады. Бактерияларды сәйкестендіру үшін 16S рРНҚ гені алдымен консервативті аймақтарға жалғанатын праймерлерді пайдалану арқылы полимеразалық тізбекті реакция көмегімен амплификацияланды, содан кейін секвенирленді. Секвенирлеу нәтижелері биоинформатикалық талдау арқылы өңделіп, вариабельді аймақтар бактериалдық таксондарды ажырату үшін қолданылды. Бақылау (ластанбаған) үлгілерде Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria және Bacteroidetes топтарының бар екені анықталды.

Мұнай енгізілгеннен кейінгі алғашқы 15 тәулік ішінде микробиомда алкандар мен полициклді ароматты көмірсутектердің катаболизміне қатысатын гендердің кең жиынтығына ие актинобактериялар мен протеобактериялардың үлесінің артқаны анықталды. Сондай-ақ бациллалардың болуы байқалды. Тәжірибенің 60-тәулігінде таксономиялық алуантүрлілік пен қауымдастық құрамы тұрақтану және микробиомның бастапқы күйіне қайту үрдісін көрсетті, бұл үлгі құрамы бойынша бақылау үлгісіне ұқсас болды. Бұл деректер әдебиет көздеріндегі мәліметтермен сәйкес келеді, яғни топырақтың аборигенді микробиомдары алғашқы 2–3 ай ішінде стресс факторына микробтық жауап көрсетіп, кейін бастапқы күйіне қайта тұрақтанатыны белгілі.

Зерттелген топырақта, яғни мұнаймен ластанбаған және мұнаймен ластанған үлгілерде, культивирленетін микроорганизмдердің жалпы саны 60 тәулік бойы жоғары болмады және шамамен 2–4×10⁶ КТБ/г топырақты құрады. Мұнайды ыдыратушы микроорганизмдердің саны алғашқы 30 тәулік ішінде төмен болып, 2–4×10² КТБ/г топырақ шамасында болды (бұл культивирленетін микроорганизмдердің жалпы санының шамамен 0,01%-ын құрады). Алайда 60-тәулікке қарай мұнайды ыдыратушы микроорганизмдер санының 4–5×10³ КТБ/г топыраққа дейін аздап артқаны байқалды (жалпы санның шамамен 0,1%-ы).

Мұнаймен тотығатын микроорганизмдердің перспективалы дақылдары бөлініп алынды. Бұл микроорганизмдер мұнайда, дизель отынында, н-алкандарда (гексадекан), полициклді ароматты көмірсутектерде (нафталин), сондай-ақ моноциклді ароматты көмірсутектерде (толуол, фенол) өсу қабілетіне ие.