Project objectives

Task 1. Extraction of vegetable oil from rice bran and determination of optimal methods for oil isolation using different approaches (selection of extractants, supercritical fluid extraction, microwave-assisted extraction). This task will be accomplished through optimization of the extraction process and identification of the most efficient method for maximizing oil recovery from bran.

Task 2. Establishment of the relationships governing the glycerolysis reaction, including the influence of the reactivity of differently substituted carboxylic acids, reaction temperature, ratio of reacting components, as well as electronic and steric effects. Purification of the obtained mono- and diglycerides of fatty acids from impurities using chromatographic methods and isolation of individual compounds. This task will be accomplished by determining optimal process conditions.

Task 3. Development of methods for the synthesis of mono- and diglycerides of fatty acids containing pharmacophore fragments for the targeted preparation of compounds with antitumor activity. Synthesis of mono- and/or diglycerides of fatty acids with phosphorus-containing derivatives (phosphorus amides such as hexaalkyltriamidophosphites and phosphorus acid chlorides). Determination of optimal synthesis conditions and characterization of the structures of the obtained compounds. Development of approaches for the targeted synthesis of cationic analogues of glycerophospholipids. Development of approaches for the synthesis of mono- and diglycerides of fatty acids containing sterically hindered phenolic fragments.

Task 4. Structural elucidation and investigation of physicochemical and surface-active properties of the synthesized compounds. This task will be accomplished using modern physicochemical analytical methods such as NMR spectroscopy, IR spectroscopy, gas chromatography–mass spectrometry, high-performance liquid chromatography, and others.

Task 5. Investigation of the biological activity of the obtained compounds:
(1) Analysis of the cytotoxic profile toward tumor and normal cells;
(2) Elucidation of cytotoxic mechanisms, including induction of apoptosis and effects on cell migration and proliferation;
(3) Determination of antioxidant status, including effects on lipid peroxidation and direct antiradical activity.

Ожидаемые результаты

В результате первого года выполнения проекта будут разработаны оптимальные условия получения моно-, диглицеридов жирных кислот выделяемых из растительного масла рисовых отрубей. Будут установлены закономерности реакции переэтерификации от реакционной способности различно замещенных карбоновых кислот, от температуры реакционной среды и соотношения реагирующих компонентов, электронных и пространственных эффектов. В 2024 году и 2025 году будут синтезированы новые производные глицерофосфолипидов взаимодействием глицеридов с фосфорорганическими соединениями (хлорангидриды и амиды фосфора). На основе полученных данных будут подобраны наиболее оптимальные условия реакции, обеспечивающие наибольший выход целевых соединений.В результате проведенных работбудут получены оптимальные способы модификации глицеридов жирных кислот. В ходе второго (2025) года также планируется изучить возможность функционализации производных глицеридов жирных кислот с Р- и N-нуклеофилами (вторичными аминами, трифенилфосфином). Впервые будут получены новые производные глицеридов, имеющих в своем составе аминоалкильные, аммониевые, фосфониевые фрагменты. В результате используемые подходы позволят подойти к целенаправленному созданию митохондриально-ориентированных векторных систем для улучшения противоопухолевой активности глицеридов жирных кислот. С целью синтеза соединений, проявляющих антиоксидантную активность, будут изучены реакции производных глицеридов с сесамолом, тимолом и другими доступными фенолами природного происхождения. В продолжение этих исследований в 2026 году впервые будет изучена возможность введения в моно- и диглицериды жирных кислот пространственно-затрудненных фенольных фрагментов, которые позволят осуществить синтез соединений, оказывающих защитное действие по отношению к здоровому микроокружению и цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам.

2024-2026 гг. Будет изучена цитотоксичность полученных соединений в отношении ряда клеточных линий опухолевого происхождения, включая HeLa (карцинома шейки матки человека), SH-SY5Y (нейробластома человека), A549 (аденокарцинома лёгкого человека), MCF7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека), PA-1 (тератокарцинома яичника человека), Hep2 (карцинома гортани), IMR-32 (нейробластома), а также условно нормальные клетки, полученные из эмбриональной почки человека, HEK-293, с использованием в качестве препаратов сравнения известных лекарственных средств, используемых для терапии онкозаболеваний. Более того, для каждого вещества будут определены индексы селективности с целью выявления соединений, обладающих избирательностью токсического действия именно в отношении клеток опухолевого происхождения. По итогам исследования цитотоксического профиля будет произведен отбор веществ, обладающих выраженной способностью снижать выживаемость клеток опухолевого происхождения и изучены возможные механизмы действия с целью выявления соединений, способных модулировать процессы, связанные с окислительным стрессом, оказывать деструктивное влияние на функционирование митохондрий, а также апоптоз, пролиферацию и миграцию опухолевых клеток. На основе полученных данных будут установлены закономерности «структура-свойство» в ряду производных глицеридов жирных кислот и выявлены наиболее активные соединения-лидеры, перспективные с точки зрения дальнейших исследований и практического внедрения.

1) Полученные в ходе работы результаты будут опубликованы в 5ти публикациях по научному направлению проекта в рецензируемых научных изданиях International Journal of Molecular Sciences (Q1, индекс цитирования 5,6), Pharmaceuticals (Q2, индекс цитирования 4,6), Frontiers in Chemistry (Q1, индекс цитирования 5,5), Anti-Cancer Agentsin Medicinal Chemistry (Q3, индекс цитирования 2,3) или в других индексируемых в Science Citation Index Expanded и входящих в Q1-Q3 по импакт-фактору в базе Web of Science и (или) имеющих процентиль по CiteScore в базе Scopus не менее 60 (шестидесяти); а также 1 статье или обзоре в издании Химический журнал Казахстана или в других изданиях в рецензируемом зарубежном или отечественном издании, рекомендованном КОКСНВО, а также представлены на международных конференциях.

2) опубликование монографий, книг и (или) глав в книгах зарубежных и (или) казахстанских издательств не планируется;

3) получение патентов в зарубежных патентных бюро (европейском, американском, японском), в казахстанском или евразийском патентном бюро: будет получен патент РК на изобретение;

4) разработка научно-технической, конструкторской документации не планируется;

5) распространение результатов работ среди потенциальных пользователей, сообщества ученых и широкой общественности: распространение результатов исследований будут осуществляться участием в международных научных конференциях, через республиканские и региональные средства массовой информации и социальные сети;

6) другие измеримые результаты в соответствии с требованиями конкурсной документации и особенностями проекта. Дополнительно в разделе указываются:

1) область применения и целевые потребители каждого из ожидаемых результатов: В результате реализации предлагаемого проекта будет получена обширная библиотека ранее не описанных производных глицеридов жирных кислот, обладающих высокой цитотоксичностью в отношении раковых клеточных линий, проведен анализ «структура-активность» и выявлены соединения-лидеры, обладающие высокой селективностью действия и нетоксичные в отношении нормальных тканей и клеток. Это, в свою очередь, послужит основой дальнейшему созданию новых типов противоопухолевых агентов и будет способствовать развитию медицинской химии и химии лекарственных препаратов, а также будет являться надежной базой для практического внедрения новых типов высокоселективных и малотоксичных противоопухолевых агентов.

2) влияние ожидаемых результатов на развитие основного научного направления и смежных областей науки и технологий: в качестве целевых потребителей научных результатов проекта могут стать фармацевтические компании, поскольку полученные соединения потенциально будут проявлять широкий спектр биологической активности, пониженную токсичность и смогут быть достойными конкурентами дорогостоящим зарубежным аналогам;

3) применимость и (или) возможность коммерциализации полученных научных результатов: Полученные научные результаты могут использоваться в фармацевтической промышленности и медицине в качестве противоопухолевых препаратов, а также в учебно-образовательном процессе при усовершенствовании учебных планов, разработке лабораторных работ и практик для студентов различных курсов;

4) социальный, экономический, экологический, научно-технический, мультипликативный и (или) иной эффект результатов проекта с обоснованием, в том числе по решению существующих проблем в регионах страны: Результаты, полученные в ходе выполнения данного проекта, существенно расширят современные представления в области органической, медицинской химии, и найдут отражение в современном направлении исследований – валоризация агроотходов.

5) другие прямые и косвенные результаты проекта с указанием их качественных и количественных характеристик: Презентацию результатов планируется провести на международных и отечественных конференциях.

Результаты

Получены растительные масла из рисовых отрубей. Проведена оценка влияния растворителей на процесс экстракции масла из растительного сырья. Обнаружено, что применение этилацетата имел более высокие выходы экстракции в начале и достигал своего максимального выхода за более короткий промежуток времени чем использование других растворителей (ацетон, гексан, хлороформ, ксилол, бензол) из-за лучшей совместимости с маслянистыми соединениями, присутствующими в рисовых отрубях, и его более низкой вязкости. Осуществлен глицеролиз рисового масла с целью получения моно- и диглицеридов жирных кислот различного состава. Обнаружено, что получаемые моно- и диглицериды жирных кислот преимущественно содержат линоленовую и олеиновую кислоты. Применение инструментальных методов анализа (ВЭЖХ, ГЖХ, спектроскопии ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрии) позволили определить состав полученных масел, моно- и диглицеридов жирных кислот.

Разработан оптимальный метод получения моно- и диглицеридов реакцией глицеролиза из растительного масла рисовых отрубей и выделены из реакционных смесей индивидуальные моно- и диглицериды с использованием хроматографии. Применение инструментальных методов анализа (ВЭЖХ, ГЖХ, спектроскопии ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрии) позволили определить состав полученных масел, моно- и диглицеридов жирных кислот Обнаружено, что получаемые моно- и диглицериды жирных кислот преимущественно содержат линоленовую и олеиновую кислоты. Полученные индивидуальные соединения идентифицированы методами ИК-, ЯМР ¹Н и ¹³С спектроскопии, элементного анализа.

Изучено взаимодействие моно-, диглицеридов олеиновой и линоленовой кислот, выделенных из рисового масла, с хлорангидридом фосфора (POCl₃) в присутствии различных оснований (триэтиламин, пиридин, DBU), растворителей (диоксан, толуол, хлороформ, гексан) при комнатной температуре. Установлено, что наиболее оптимальным растворителем в реакции фосфорилирования глицеридов с POCl₃ является толуол и основание триэтиламин. Кроме этого, было обнаружено, что получаемые в результате реакций дихлорангидриды фосфора моно- или диглицеридов жирных кислот претерпевают частичный гидролиз в процессе их выделения, а добавление дистиллированной воды после удаления растворителей позволяет нам получать соответствующие глицеридофосфаты. Осуществлен синтез хлорангидридов бис(хлорметил)фосфиновой и хлорметилфосфоновой кислот по ранее известным методикам и изучена их возможность взаимодействия в присутствии триэтиламина в толуоле при комнатной температуре с моно- и диглицеридами олеиновой и линоленовой кислот. Показано, что в случае реакции глицеридов с хлорметилфосфоновой кислотой происходит гидролиз связи P-Cl с образованием соответствующих эфиров фосфора. Таким образом, в результате проведенных исследований нами были выявлены закономерности протекания реакции фосфорилирования, позволяющие получать эфиры фосфорных кислот диглицеридов олеиновой или линоленовой кислот, а также моноглицеридов олеиновой или линоленовой кислот в виде смесей различного состава. Все синтезированные соединения были охарактеризованы с использованием физико-химических методов анализа (спектроскопия ЯМР-, ИК-, масс-спектрометрия, ВЭЖХ). Для получения индивидуальных продуктов из полученных смесей эфиров фосфорных кислот моноглицеридов олеиновой и линоленовой кислот был осуществлен подбор элюентов различного состава для их дальнейшего выделения методом колоночной или флэш хроматографии.

В рамках исследования биологических свойств все синтезированные на первом году проекта соединения протестированы в соответствии с планом.

С использованием МТТ-теста, основанного на способности бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток, оценено влияние полученных веществ на выживаемость клеток различного происхождения - опухолевого (SH-SY5Y нейробластома человека, HeLa карцинома шейки матки человека, Hep2 карцинома гортани человека, А549 аденокарцинома легкого человка) и нормального (HEK-293 клетки, полученные из эмбриональной почки человека). Установлено, что полученные соединения в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкМ не проявляют выраженных цитотоксических свойств, снижая жизнеспособность клеток не более чем на 13,24±0,98%, при этом отличий в проявляемом действии в зависимости от клеточных линий не было выявлено, что свидетельствует об отсутствии селективности действия веществ (SI < 1).

Оценка влияния веществ на процессы, связанные с окислительным стрессом, посредством анализа их влияния на перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс, основанного на реакции 2-тиобарбитуровой кислоты с промежуточными продуктами перекисного окисления липидов, в результате которой образуется окрашенный триметиновый комплекс, главная роль при образовании которого принадлежит малоновому диальдегиду, позволила обнаружить, что полученные соединения в концентрации 100 мкМ обладают умеренной антиоксидантной активностью в диапазоне от 21,06±0,33% до 32,76±3,31%.

При оценке антирадикальной активности соединений посредством анализа способности веществ нейтрализовать хромоген-радикал ДФПГ(2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) и железохелатирующей способности с помощью метода, основным принципом которого является конкурентное связывание веществ-хелаторов и феррозина ((3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-фенилсульфоновая

кислота)-1,2,4-триазин)) с ионами железа, не было обнаружено способности веществ нейтрализовать свободные радикалы и оказывать железосвязывающие свойства, что может быть связано с иным механизмом антиоксидантного действия соединений.

При исследовании возможных механизмов противоопухолевого действия соединений, а именно, способности приводить к митохондриальной дисфункции, запускать гибель опухолевых клеток по пути апоптоза и оказывать влияние на пролиферацию и миграцию клеток опухолевого происхождения, не было обнаружено активности веществ в отношении вышеуказанных процессов, что свидетельствует о необходимости проведения дальнейших химических модификаций полученных соединений с целью создания более эффективных молекул с противоопухолевым типом действия.

Neganova, M., Aleksandrova, Y., Voloshina, A., Lyubina, A., Appazov, N., Yespenbetova, S., Valiullina, Z., Samorodov, A., Bukharov, S., Gibadullina, E., Tapalova, A. and Bogdanov, A. / Biological Activity Evaluation of Phenolic Isatin-3-Hydrazones Containing a Quaternary Ammonium Center of Various Structures // International Journal of Molecular Sciences, 2024. Vol. 25(20), 11130.

https://doi.org/10.3390/ijms252011130

https://www.mdpi.com/1422-0067/25/20/11130

По результатам проведённых исследований опубликован 1 тезис в XII Международном Беремжановском съезде по химии и химической технологии на тему: Получение моноглицеридов жирных кислот из рисового масла / Алимхан Б.Г., Аппазов Н.О. // XII Международный Беремжановский съезд по химии и химической технологии, 4-6 декабря, 2024, Алматы, Казахстан. Сборник тезисов докладов [Электронное издание]. — Алматы: НАО «КазНУ им. аль-Фараби», 2024. – C. 109.

https://beremzhanovcongress.kz/ru/glavnaya/

https://beremzhanovcongress.kz/wp-content/uploads/2024/12/%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BD%D0%B8%D0%BA-3-1.pdf

* Подготовлен промежуточный отчет, содержащий полную информацию о: выделении из рисовых отрубей растительных масел; подборе оптимального метода получения из растительного масла моно- и диглицеридов; синтезе хлорангидридов фосфора (например, хлорангидриды фосфиновой и фосфоновой кислот) и проведении комплексного тестирования in vitro потенциальной противоопухолевой активности соединений, выделенных и синтезированных на первом году реализации проекта.